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典型应用

上海劲马技术分析:WB实验小问答
阅读次数:20 发布时间:2020/6/30 10:55:06
    WB又称免疫印记法.是将生物大分子物质通过不同途径转移到固相载体的过程。其灵敏,可达ng级,用Ecl显色法理论上可达pg 级。方便,特异性高。今天给大家分析的是western blot实验中那些常见的问题,这份干货内容,请收好啦!

    western blot 常见问题有那些?
    1.为什么我的细胞提取液中没有目标蛋白?
    答:原因有很多,①你的细胞中不表达这种蛋白质,换一种细胞;②你的细胞中的蛋白质被降解掉了,你必需加入PMST,抑制蛋白酶活性;③你的抗体不能识别目标蛋白,多看看说明,看是否有问题。

    2.我的细胞提取液有的有沉淀,有的很清亮,为什么呢?
    答:①有沉淀可能是因为你的蛋白没有变性完全,可以适当提高SDS 浓度,同时将样品煮沸时间延长。②也不排除你的抗原浓度过高,这时再加入适量sample buffer即可。

    3.我做的蛋白质分子量很小(10KD),请问怎么做WB?
    答:可以选择PSQ膜,同时缩短转移时间。也可以将两张膜叠在一起,再转移。其他按步骤即可。

    4.我的目的带很弱,怎么加强?
    答:可以加大抗原上样量。这是*主要的。同时也可以将一抗稀释比例降低。
 
 
    实验方法互助区——蛋白区

    5.胶片背景很脏,有什么解决方法?
    答:减少抗原上样量,降低一抗浓度,改变一抗孵育时间,牛奶浓度提高。

    6.目标带是空白,周围有背景,是为什么?
    答:你的一抗浓度较高,二抗上HRP 催化活力太强,同时你的显色底物处于一个临界点,反应时间不长,将周围底物催化完,形成了空白。将一抗和二抗浓度降低,或更换新底物。

    7.我的胶片是一片空白,是怎么回事?
    答:如果能能够排除下面的几个问题那么问题多半出现在一抗和抗原制备上。
    ①二抗的HRP 活性太强,将底物消耗光;②ECL底物中H2O2,不稳定,失活;③ECL底物没覆盖到相应位置;④二抗失活。

    8.问我显影液显影1分钟,和5分钟后,底片漆黑一片,是什么原因呢?
    答:①可能是红灯造成的,可以在完全黑暗的情况下操作,看是否有改善。胶片本来就被曝光了②显影时间过长。

    9.DAB好还是ECL好?
    答:DAB 有毒,但是比较灵敏,是HRP *敏感的底物;ECL结果容易注册免费送体验金平台,但被催化时灵敏度差一点,但如果达到阀值,就特别灵敏,可以检测pg 级抗原。要看你实验的情况。

    10.抗原分子量是资料上的两倍,是怎么回事?
    答:抗原形成了二聚体。增多巯基乙醇量,煮沸变性时间延长,可以打开二聚体。在上层胶中加入尿素至8M也可以打开。

    11.半干转是否要求膜,滤纸,胶同样大小?
    因为胶大小不一定规则,膜和滤纸会大一点,那样会不会短路?什么是短路?如何注册免费送体验金平台和发现短路呢?
    答:一般参照膜>= 滤纸> 胶, 就行,你转移前和转移过程中看看电压就行,正常的半干是慢慢变高的, *后结束时一般是开始的1.5-3倍都是正常的。一般Buffer和滤纸选的对就不会短路。

    12.电泳时Marker 按说明加5ul,但电泳中看不见,是失活了吗?
    答:加入20ul即可。

    13.蛋白转移不到膜上,但胶上有,同时Marker 转上去了,为什么了?
    答:可能是1样品浓度过低2转移时间不够。

    14.我的一抗量较少,同时我也不知道一抗的*佳稀释比例是多少,怎么做呢?
    答:确定实验过程无污染后,将含抗体的稀释液回收,保存于-70℃。**次的浓度做高一点,这样,如果结果不好,可以尝试再稀释。

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